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膜电位荧光探针产品专题(Probes for Membrane Potential)
>###nbsp;    作者:ag九游会原创     文章泉源:ag九游会生物    

膜电位荧光探针产品专题(Probes for Membrane Potential)

(线粒体膜电位、细胞质膜电位)


 

▶ 疾速呼应荧光探针(Fast-response fluorescent probes)

代表性:ANEP染料,RH染料

▶ 慢速呼应荧光探针(Slow-response fluorescent probes)

代表性:短链碳菁类染料,JC-1染料,罗丹明123染料,DiBAC染料

 

专题要害词:

Potentiometric probes 电位探针;Membrane Potential 膜电位;Hyperpolarization 超极化;Depolarization 去极化;Fast-response 疾速呼应;Slow-response 慢速呼应;

 

一个细胞典范的质膜跨膜电位约为70mV(胞内为负电荷)。膜电位的增长和低落,辨别称为膜超极化(Membrane hyperpolarization)和去极化(Membrane depolarization),在很多心理历程中发扬要害作用,包罗神经激动的传达、肌肉紧缩、细胞信号和离子通道门控。电位探针(Potentiometric probes)是用来研讨这些历程的紧张东西,以及用于线粒体察看(线粒体的跨膜电位约为150mV,外部基质呈负电荷),用于评价细胞生机,和用于候选新药的高通量挑选。

 

电位探针(Potentiometric probes)包罗阳离子或两性苯乙烯染料,阳离子碳花菁和罗丹明,阴离子氧鎓醇。染料的归类确定要素包罗在细胞的收集方法、反响基制和毒性。依据这些染料的光学反响、光毒性,与其他分子的互相作用,来选择符合的电位探针满意特定的用处。依据染料的光学反响可将其分为两大类:

 

一、疾速呼应探针(Fast-response probes)

1.1 事情原理

疾速呼应探针(通常为苯乙烯吡啶盐染料)经过电子布局的变革惹起荧光特性变革来事情,对四周的电子场变革做出反响(见图MK1)。在愉快细胞中其光学反响充足快以检测瞬时电位变革(毫秒ms),包罗单一神经元、心肌细胞和完备大脑。但是,它们电位依赖性的荧光变革数目级通常很小。疾速呼应探针通常状况每100mV发生2-10%的荧光变革。

 

图MK1. 膜电位敏感探针的反响基制(Response mechanisms of membrane potential–sensitive probes)。疾速呼应探针履历电子场驱动的分子内电荷散布变革,从而发生对应的光谱特性或荧光强度变革(本图经过颜色标示变革来论述)。慢速呼应探针是亲脂性阴离子(本图)或阳离子经过电泳机制转跨膜转运。荧光变革与跨膜重新散布相干(本图经过颜色标示变革来论述),归因于探针对胞内和胞外情况的敏理性。因而,电位反响速率间接表现底子历程所需的工夫常数——电子的疾速分子内重新散布&完备分子绝对较慢的跨膜活动。


1.2 疾速呼应探针品种

◇ ANEP染料

ANEP (AminoNaphthylEthenylPyridinium)染料由Leslie Loew和同事开辟,是最敏捷的疾速呼应探针。两性离子的di-4-ANEPPS(MX4038)和di-8-ANEPPS(MX4039)在种种构造、细胞和模子膜体系中体现出相称分歧的荧光变革速率(10%荧光变革/100mV)。ANEP染料毫秒级的工夫特性补偿此中等呼应振幅(见图MK2)。di-4-ANEPPS(MX4038)十分疾速被细胞内涵化,制止其用在除极短期实行之外的使用中,但是,di-8-ANEPPS(MX4039)能更好的保存在质膜的外层。别的,固然两种染料都具有精良的光波动和低毒性,报道提及di-8-ANEPPS(MX4039)比di-4-ANEPPS(MX4038)具微好的光波动性和明显更低的光毒性。

 

与其他的苯乙烯染料类似,ANEP染料在水溶性溶液内根本无荧光,出现的光谱特性激烈取决于所处情况。与磷脂小体联合后,di-8-ANEPPS(MX4039)最大吸取/发射波长约为467/631nm,绝对在甲醇内的最大引发/发射约为498/713nm。di-4-ANEPPS(MX4038)联合到神经膜的最大引发/发射波长约为475/617nm。

 

di-8-ANEPPS(MX4039)和di-4-ANEPPS(MX4038)两者皆对膜电位(超极化)增长做出呼应,~440nm引发处荧来临低,而530nm处引发荧光增长。这些光谱的迁徙容许利用比率法来联系关系化膜电位与荧光信号变革。

图MK2. 利用疾速呼应探针di-4-ANEPPS检测兔完备心脏的举措电位(Detection of action potentials in intact rabbit hearts using the fast potentiometric probe di-4-ANEPPS)。Excised rabbit hearts were loaded with di-4-ANEPPS by perfusion with dye-containing medium. Fluorescence was excited at 488 nm by an argon-ion laser. Emission components at 540 ± 6 nm (green) and >610 nm (red) were detected simultaneously by two photomultipliers (panel A). The ratio of the green to red signals (panel B) displayed a larger fractional change during action potential cycles than either of the component signals; it also followed transmembrane voltage contours recorded simultaneously by an intracellular microelectrode (panel C). In addition, fluorescence ratio measurements reduce the motion artifacts that typically distort optical signals detected from contracting hearts. Figure reproduced with permission from Am J Physiol Heart Circ Physiol (2000) 279:H1421.

 

◇ RH染料

开始由Rina Hildesheim分解,RH染料包括一系列dialkylaminophenylpolyenylpyridinium染料,次要用于神经元的功效成像。少量RH染料相似物的存在反应一种征象便是没有一种单一染料能提供一切实行条件必要的光学反响。现在,最普遍利用的RH染料是RH 237(MX4017)、RH 414(MX4019)、RH 421(MX4018)和RH 795(MX4020)。差别相似物染色的心理效应并非完全相反。比方,用RH 414(MX4019)染大脑皮层惹起动脉紧缩,用RH 795(MX4020)则不会。体外对海马脑片或体内对猫和山公视觉皮质(单细胞记载)举行检测,RH795发生可疏忽的副反响。

 

与ANEP染料类似,RH染料对膜电位变革做出反响,发生可变水平的荧光引发和发射光谱迁徙。它们的吸取和荧光光谱也激烈取决于所处情况。RH414联合到磷脂小体上的光谱相似于神经元质膜上的。联合利用RH染料和荧光钙离子指示剂容许同时对膜电位(RH237,MX4017)和胞内钙离子(Rhod-2 AM,MX4507)举行心肌单细胞层的成像检测。

 

1.3 ag九游会生物(MKBio)疾速呼应探针特性和使用汇总

探针称号

布局(电荷)

光学反响

代表性使用

Di-4-ANEPPS (MX4038) 
Di-8-ANEPPS (MX4039) 

Di-2-ANEPEQ(MX4040)

阳离子或两性离子苯乙烯(Styryl )

疾速呼应

遇上膜超极化后440/505nm荧光强度引发比低落

①光学电位和电物理学联合测定;

②电势和Ca2+联合测定;;

③完备心脏构造的电活性成像;

④呼应药理学安慰的膜电位变革;

⑤双光子引发显微剖析;

RH 237(MX4017)

RH 414(MX4019)

RH 421(MX4018)

RH 795(MX4020)

阳离子或两性离子苯乙烯(Styryl )

疾速呼应;

遇上膜去极化荧来临低。

①心肌细胞和心肌构造的电子活性;

②神经元的功效示踪;;

③视觉和听觉安慰激活的膜电位;

 

1.4 ag九游会生物(MKBio)疾速呼应探针产品信息

货号

称号

规格                   

Ex/Em(nm)     

代价(元)          

MX4038-5MG        

Di-4-ANEPPS 膜电位荧光探针

5mg

~465/635

2290

MX4039-5MG

Di-8-ANEPPS 膜电位荧光探针

5mg

~465/635

2790

MX4040-5MG

Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) 膜电位荧光探针     

5mg

~465/635

2790

MX4017-5MG

RH 237 膜电位荧光探针

5mg

~528/782

1580

MX4018-5MG

RH 421 膜电位荧光探针

5mg

~515/704

1580

MX4019-5MG

RH 414 膜电位荧光探针

5mg

~532/716

2380

MX4020-1MG

RH 795 膜电位荧光探针

1mg

~530/712

2100

 

二、慢速呼应探针(Slow-response probes)

2.1 事情原理

慢速呼应探针依据跨膜散布体现出电位依赖的变革,随之是荧光的变革(见图MK1)。

图MK1. 膜电位敏感探针的反响基制(Response mechanisms of membrane potential–sensitive probes)。疾速呼应探针履历电子场驱动的分子内电荷散布变革,从而发生对应的光谱特性或荧光强度变革(本图经过颜色标示变革来论述)。慢速呼应探针是亲脂性阴离子(本图)或阳离子经过电泳机制转跨膜转运。荧光变革与跨膜重新散布相干(本图经过颜色标示变革来论述),归因于探针对胞内和胞外情况的敏理性。因而,电位反响速率间接表现底子历程所需的工夫常数——电子的疾速分子内重新散布&完备分子绝对较慢的跨膜活动。

 

2.2 慢速呼应探针品种

◇ 碳花菁染料(DiI, DiS and DiO Derivatives)

带短烷基尾(<7个碳原子)的DiI,DiS和DiO属于第一代开辟的电位荧光探针。这些阳离子染料收集在超极化的膜上,然后转运进入脂质双分子层。收集进入关闭的膜外部通常惹起低落的荧光,固然变革幅度和荧光反响的偏向激烈取决于染料浓度和染料的布局特性。

 

DiOC6(3) (MX4009) 是最普遍利用的膜电位测定用碳花菁染料,紧随厥后的是DiOC5(3) (MX4032) 。流式测定中,碳花菁荧光强度的测定不但取决于膜电位,也受细胞巨细影响。某些状况下,前散射荧光的测定通常用来尺度化细胞巨细变量惹起的光学变量。荧光比率法接纳DiOC2(3) (MX4008) 在发射光谱内的电位依赖红光迁徙来测定细菌膜电位(见图MK3)。碳花菁染料,分外是thiacyanines(好比DiSC3(5),MX4033 ),能克制呼吸,因而大概具有绝对细胞毒性。


     

图MK3. 金黄色葡萄球菌菌群经30µM DiOC2(3)染色的双色流式剖析图(Two-color flow cytometric analysis of Staphylococcus aureus populations stained with 30 µM DiOC2(3) in the presence (red) or absence (blue) of the metabolic uncoupler CCCP. N ote the variability (~100-fold range) of the green and red fluorescence intensities. B) The same data expressed as red/green fluorescence intensity ratios. Ratio values are calculated by subtracting the logarithmic green fluorescence channel value from the corresponding logarithmic red fluorescence channel value.

 

◇ JC-1和JC-10

JC-1 (MX3203)在低浓度或低膜电位下呈绿色荧光单体,但是,在更高浓度(水溶性浓度>0.1uM)或更高电位,构成白色荧光的J-收集体(J-aggregates),具宽引发光谱和十分窄的发射光谱。由于J-收集体构成的增长与肯定范畴内(30-180mV)膜电位的变革呈线性干系,这一征象则可被电位测定所接纳(见MK4 JC-1事情原理表示图)。绝对于质膜,JC-1更特异性辨认线粒体膜电位。比其他的阳离子染料好比DiOC6(3)和罗丹明123,去极化呼应的继续性更好。

 

种种范例的比率测建都可举行,经过组合绿色荧光JC-1单体(Ex/Em~514/529nm)和白色荧光J-收集体(Ex/Em~585/590nm),后者能在485nm-最大吸取波长的范畴内被无效引发。用于检测荧光素(FITC)和四甲基罗丹明的光学滤片能辨别用来检测单体和收集体情势。别的,两种情势能同时用荧光素长通光学滤片设置来检测。关于流式检测,JC-1能用488nm引发,经过二元形式辨别用绿色通道检测单体和白色通道检测J-收集体。

 

JC-1广泛用于检测凋亡细胞的线粒体去极化(JC-1线粒体膜电位检测试剂盒,MX3204-100T)和剖析多药耐药细胞。也常用来评价基于细胞高通量测定的线粒体功效评价。JC-10是JC-1的晋级版本,荧光特性相似于JC-1,探针自己具更好的水溶性。


图MK4. JC-1进入线粒体和天生J-收集体的示例流程图(Schematic illustration depicting JC-1 entry into the mitochondria and the generation of J aggregate)。JC-1,阳离子碳菁类染料(绿色)以膜电位依赖情势收集在线粒体并开端构成J-收集体(白色)。当产生去极化,仍坚持单体情势,呈绿色荧光。(文献泉源:Sivandzade F et al. Analysis of the Mitochondrial Membrane Potential Using the Cationic JC-1 Dye as a Sensitive Fluorescent Probe. Bio Protoc. 2019 Jan 5;9(1). PMID: 30687773)

 

◇ Rhodamine 123, TMRM and TMRE

罗丹明123(MX3208)广泛用做线粒体的布局标记物和线粒体活性的指示剂。


TMRM(MX4306)和TMRE(MX4305)辨别是四甲基罗丹明的甲酯和乙酯情势,布局十分相似于罗丹明123。次要用作线粒体膜电位感到器。与罗丹明123(MX3208)一样,这些阳离子染料收集在线粒体,由于自淬灭荧光削弱。TMRM(MX4306)和TMRE(MX4305)比罗丹明123能更快的穿过质膜,它们的强荧光容许利用低浓度的探针,从而制止探针收集。大鼠心肌细胞,TMRM(MX4306)与X-rhod-1 AM同时利用共聚焦成像线粒体膜电位和钙离子。活细胞内TMRE(MX4305)乐成用于高通量挑选影响线粒体膜电位的药物。


DiBAC(Bis-Oxonols)

三种双巴比妥酸氧鎓醇,通常统称为DiBAC染料,构成一个光谱异乎寻常[yì hū xún cháng]的的电位探针家属,最大引发波长约为490nm(DiBAC4(3) (MX4029) ),530nm(DiSBAC2(3) (MX4030))和590nm(DiBAC4(5) (MX4031) )。有几篇文章复杂界说这些染料为双氧鎓醇(bis-oxonol),则总是很难确定究竟用的是哪一种染料。不外,少量利用双氧鎓醇(bis-oxonol)的文章利用的次要为DiBAC4(3) (MX4029)。


这些染料进入去极化细胞,与胞内卵白或膜联合,体现处荧光加强和红光迁徙。去极化越高,内流进入细胞的阴离子染料越多,则荧光增长。相反,超极化随之而来的是荧来临低(图MK5)。与阳离子碳菁类染料相反,阴离子双氧鎓醇大要被线粒体排挤,次要对细胞质膜电位敏感。DiBAC4(3) (MX4029)发生的电位依赖荧光变革典范为~1%/mV。阴离子氧鎓醇和阳离子K+-缬氨霉素复合体之间的互相作用使得在校准电位反响时用此离子载体变得庞大化。氧鎓醇类染料对种种离子通道和受体出现出已知的药理活性。因而,在利用这些荧光探针的任何实行的状况下,都必要确定实行自己失掉的心理效应与外用参加探针浓度是有关联的,这一步调非常紧张。


图MK5. Detection of ATP-sensitive potassium (KATP) channel activation in isolated capillaries from guinea pig hearts using DiBAC4(3), a slow potentiometric probe. Application of a K+ channel opener (HOE 234) induced membrane hyperpolarization, resulting in a net efflux of intracellular DiBAC4(3), which is registered as a decrease of fluorescence intensity. These effects were reversed by subsequent treatment with the channel blocker glibenclamide.(文献泉源:Langheinrich U et al. Hyperpolarization of isolated capillaries from guinea-pig heart induced by K+ channel openers and glucose deprivation. J Physiol. 1997 Jul 15;502 ( Pt 2):397-408. PMID: 9263919)

 

2.3 ag九游会生物(MKBio)慢速呼应探针特性和使用汇总

探针称号

布局(电荷)

光学反响

代表性使用

DiOC2(3) (MX4008) 
DiOC5(3) (MX4032) 
DiOC6(3) (MX4009) 
DiSC3(5) (MX4033) 

阳离子碳花菁(Carbocyanine)

慢反响;

取决于染料浓度和检测办法对去极化

做出荧光反响。

①细菌熏染;

②流式剖析膜电位;

③完备酵母细胞的膜电位剖析;

④线粒体活性;

⑤氧化应激;

JC-1(MX3203, MX3204)

JC-10 (MX3206, MX3207)

阳离子碳花菁(Carbocyanine)

慢反响;

遇上膜超极化后585/520nm荧光强度

发射比增长

①凋亡线粒体去极化;

②线粒体的Ca2+调控;

③培育神经元的线粒体功效;

④氧化应激的线粒体反响;

TMRE(MX4305)

TMRM(MX4306)

Rhodamine 123(MX3208)

阳离子罗丹明(Rhodamine)

慢反响;

用于获取呆电位依赖性染料散布的无偏图像。

①线粒体的Ca2+调控;

②线粒体膜通透性转换;

③氧化应激;

④干细胞;

DiBAC4(3) (MX4029) 
DiBAC4(5) (MX4031) 
DiSBAC2(3) (MX4030)

阴离子氧鎓醇(Oxonol)

慢反响;

遇上膜超极化后荧来临低。

①ATP敏感的K+通道活化;

②电势和Ca2+联合测定;

③膜电位的共聚焦成像;

④细胞生机的流式剖析;

 

2.5 ag九游会生物(MKBio)慢速呼应探针产品信息

货号

称号

规格

Ex/Em(nm)

代价(元)       

阳离子碳花菁(Carbocyanine)

MX4008-100MG        

DiOC2(3) 绿色膜电位荧光探针

100mg              

~482/497

858

MX4009-10MG

DiOC6(3) 内质网荧光探针

10mg

~484/501

358

MX4032-25MG

DiOC5(3) 膜电位荧光探针

25mg

~482/503

1080

MX4033-50MG

DiSC3(5) 膜电位荧光探针

50mg

~660/675

998

阳离子碳花菁(Carbocyanine)

MX3203-1MG

JC-1线粒体膜电位荧光探针

1mg

~515/529 & 590 nm

588

MX3204-100T

JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit

100T

~515/529 & 590 nm

845

MX3206-1MG

JC-10线粒体膜电位荧光探针

1mg

~515/529 & 570 nm

648

MX3207-100T

JC-10 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit

100T

~515/529 & 570 nm

1800

阳离子罗丹明(Rhodamine)

MX3208-5MG

Rhodamine 123 罗丹明123

5mg

~511/534

280

MX4305-25MG

TMRE 四甲基罗丹明乙酯

25mg

~549/574

1450

MX4306-25MG

TMRM 四甲基罗丹明甲酯

25mg

~549/574

1450

阴离子氧鎓醇(Oxonol)

MX4029-25MG

DiBAC4(3) 膜电位荧光探针

25mg

~493/516

1486

MX4030-25MG

DiSBAC2(3) 膜电位荧光探针

25mg

~535/560

1486

MX4031-25MG

DiBAC4(5) 膜电位荧光探针

25mg

~590/616

1966

 

相干产品(电位探针校准用)

货号

称号

规格                 

代价(元)         

MS0049-10MG     

Valinomycin 缬氨霉素(K+ionophore)

10mg

520

MS0078-50MG

Gramicidin 短杆菌肽 (Pore-forming antibiotic)        

50mg

298

 

 

—Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBioag九游会一切】



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